Molecular Biology 728x

Molecular Biology 728x

Assays


DNAポリメラーゼの活動の計測より

  • Incorporation assay
  • Primer extension assay

複製フォークより

  • ヘリカーゼの活動の計測

ReplicationGenesとその見つけ方より

  • Biochemical Fractionation

複製の開始に関わるassay達より

  • EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assay (Gel Shift Assayとも)。ラベルをつけたDNAにタンパク質をくっつけて電気泳動。重いと動きが遅いので。
  • DNase I Protection assay (footprint assay) 。DNAの片方のstrandの末端にラベルづけし、タンパク質を加えて反応させて、DNase Iを加えてニックを入れて電気泳動(probeからnickまでの長さが検出されるが、タンパク質に守られた所はnickが入らないのでそこだけ空白になる)
  • DNA unwinding assay. ssDNAだけにnickを入れるなにかを使ってfootprintと同じような事をする。KMnO4やssDNA endonucleaseが使われる。
  • Template Association Assay: マグネットビーズをつけたtemplateにタンパク質を結合させてマグネットで釣り上げる。

真核生物の複製の始動より

  • ChIP (Chromatin immunoprecipitation) ヘリカーゼのloadingに関するassay。ヘリカーゼをくっつけて裁断して測る。

Transcription入門より

  • RT-PCR 2つのDNAプローブを使ってReverse TranscriptaseしたあとPCRする事で目的のRNAがどれだけあるかを測る
  • RealTIme RT-PCR (RTRT-PCR)
  • RNA-Seq 全mRNAのcDNAを作ってDeep Seqする事で相対的なmRNAの量を調べる
  • GRO-Seq 転写途中のRNAポリメラーゼに、BrUTPを合成させる事でその時点で転写が進行中のmRNAを調べる

バクテリアのTranscription入門のTranscriptionのプロモーターのマッピングより

  • Promoter Fusion Assay

EukaryoticTranscriptionのDNABindingRegulators

  • SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) … DNAのどういう配列にタンパク質が結合しやすいかを調べる。ランダムな配列のオリゴヌクレオチドをたくさん入れて結合させて、残ったものをamplifyしてどの配列が一番多く結合するかを調べる。アレンジしてRNAで使われる事も(SplicingRegulationを参照)