共通の項目
| 同じ項目 | RNAポリメラーゼ | DNAポリメラーゼ |
|---|---|---|
| 3’末端にだけ追加 | Yes | Yes |
| 塩基の追加にはDNAテンプレートが必要 | Yes | Yes |
| 4つのrNTPs/dNTPsのどれに対しても一つのアクティブサイトで賄う | Yes | Yes |
異なる項目
| 違う項目 | RNAポリメラーゼ | DNAポリメラーゼ |
|---|---|---|
| 使われるNTPs | rNTPs | dNTPs |
| プライマーが必要か？ | 不要 | 必要 |
| fidelity | 10^4 bpに一回のミス | もっとずっと少ない |
| rate | 60-100 nt/sec | 1000 nt/sec |
| processivity | 4000 nt/binding 以上 | より低い |
| DNA strandsのコピー | 一方向で、1 strandだけコピー | 両方のstrands |
Gene by Gene Expression
Global Transcription
DNAポリメラーゼの活動の計測と同様のassay。 ラベルとしてはrNTPのうちrUTPを使う事が多い。
生産物を分離する方法はDNAポリメラーゼの時と同様にFilter BindingかGel Electrophoresisを使う。
Gel Electrophoresisの場合はRNAが折りたたまれてしまう問題に対処する必要があるので、 denaturing gelを使う事。
denaturing gelとしてはたくさんの尿素をゲルに含めるのが手頃。
また、Transcriptionの結果を分析する場合、initiationはpreciseだがterminationはimprecise（開始地点はいつも同じだが終了場所はばらつきがある、という事か）という事にも気をつける必要がある。
そこで、run-off transcription assayと呼ばれる手法を使う。
| メリット | デメリット |
|---|---|
| 早い | Start siteは分からない |
| 定量的 |
DNAポリメラーゼの活動の計測と同じようなassayだが、目的も使う道具も違う。今回はTranscription Start Sitesを調べるのに使う。
結果の長さを測る事で結合した場所から端までの場所が分かり、シーケンスのどこがTSSかを特定する事が出来る。
reverse transcriptaseはテロメアの所でtelomeraseとして登場していた。他にもレトロウィルスなどで出てくる。
| メリット | デメリット |
|---|---|
| 5’末端の正確な情報が得られる | 一度に一つのgeneについての情報しか分からない |
| sensitivityがlow〜medium程度（少量発現するgeneには向かない） |
目的のRNAがどれだけ存在しているかを調べるassay。
Reverse Transcriptase PCR。略してRT PCR。ただしこれはReal Time PCRと組み合わせて使う事も多く、その場合は RT RT-PCRになる。
手順
これで目的のRNAが相対的にどのくらい多く存在しているかを確認出来る。
| 利点 | 欠点 |
|---|---|
| とてもsensitive（少量のRNAでも検出出来る） | 一度に一つのgeneしか分からない |
| 5’末端がどこかは分からない |
数十のオーダーのRNA分子でも検出出来るらしい。頑張れば一つも可能と言っているlabもあるとか。
少しノートがわかりにくかったので補足。2つのDNAプローブは、ノートの一番上に書いてある、目的の配列を含む左から右と右から左の２つのDNA片。 これでReverse Transcriptaseでどちらか片方のDNA片がextend出来てcDNAが作れて、このcDNAをもう片方のDNAをprimerとしてPCR出来る。
dsDNAの生成物を染めるdyeを使って、生成物が増えていく量を時間とともに観測する手法。 no template controlも加えてlinearの範囲を過ぎてない事を確認する必要がある。 少し汚染されてるだけでも大量に増幅するとそれが見えてしまう事があるから。
Deep sequencingを使って細胞全体について調べる。
これで存在しているmRNAの量が測れる。
Deep SequencingについてはOriginを見つける3つのassayの「Nascent Okazaki Fragment Mapping」も参照。 同じようにbinningしてそのbinの中で開始しているフラグメントの数を数える。
| 利点 | 欠点 |
|---|---|
| 転写された全geneについての情報が得られる | 本質的には定量的では無い（しかしrelative quantitationは出来る） |
| steady stateのRNAレベルを測っている（転写の量では無い） |
Global Run On Sequencingの略。run onはどんどん進む、進行する、というような意味。
RNA-SeqはあるRNAのstabilityが観測結果に影響を与えるので、Transcriptionについて調べたい時には不都合な面がある。 GRO-Seqは転写をしているRNAポリメラーゼを捉える事で転写についての直接的な情報が得られる。
手順
BrUTPはBromoのanalogue（PngNoteの5ページも参照）。 BrUTPを含むRNAを識別するantibodyが作れる。
eukaryoticの細胞ではTSSにRNAポリメラーゼがくっついて、そのままとどまっているというケースが凄く多いので、 進んでいるかどうかの違いは重要。
このassayの利点としては、進行中のtranscriptionの情報が得られる、という事。
このassayで、eukaryoticの細胞ではRNAポリメラーゼがTSSからgeneの側に進むものと、反対側に進むものの両方がある事が判明した。 ただgeneの反対側に進んで合成されるRNAはとてもunstableですぐに分解されてしまうからRNA-Seqでは見えない。 eukaryoticの細胞の多くのプロモーターはRNAポリメラーゼを両方に進める模様。
追記: 新しくRNA Polymeraseが合成を開始してしまうのはsarkosylというので防ぐらしい。