Molecular Biology 728x

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バクテリアにおけるTranscriptionのInitiation

Contents:
  1. Initiationの4つのステップ
  2. Open Complex Formation
  3. Unstable Ternary Complex Formation
    1. なぜabortive transcriptsが起きるのか?
  4. Stable Ternary Complex
    1. transient excursions model
    2. inchworming model
    3. scrunching model
  5. FRETを使ってどのモデルか調べる
    1. Transient Excursions Modelかの確認
    2. Inchworming Modelかの確認
    3. Scrunching Modelかの確認
  6. Initiation時に発生するイベントを調べるAssayたち(これまで出てきたの)
  7. Initiationを調べるAssay達(新規の)
    1. Heparin
    2. Heparinを使ったTemplate Challenge AssayのようなAssay
  8. 次:バクテリアにおけるTranscriptionのElongation

  • intercalate 挿入する、(うるう日を)入れる

バクテリアのTranscriptionのメカニズムとしては、以下の4つに分けられる。

  • initiation
  • elongation
  • termination

ここではまずInitiaationについて扱う。

Initiationの4つのステップ

initiation は4step。

  1. Closed Complex Formation
    • RNAP holoエンザイムの動員の事をそう呼ぶ
    • promoter recognitionのプロセス
    • RNAP holoが最初に結合する過程
    • RNAポリメラーゼとシグマ(と場合によってはα-CTD)とプロモーターとの相互作用で媒介される
  2. Open Complex Formation
    • dsDNAの最初のMelting
  3. Unstable Ternary Complex Formation
    • RNAの合成を開始するステップ
  4. Stable Ternary Complex
    • プロモーターから離れてRNAの合成によるelongationが始まる

α-CTDについてはバクテリアのTranscription入門でもやった通りUP elementに結合する。

Open Complex Formation

dsDNAの最初のunwindが起こる。

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  • 典型的には-11から+3にかけてunwindする(TSSが入っていることに注目)
  • この作用はRNAP holoとDNAの相互作用で駆動される
    1. βとβ’がDNAを包み込む
    2. シグマ1.1 ドメインが50Åほど移動する
      • これは負に帯電している領域で、これによりssDNAの代わりとなっている
      • 移動する事でテンプレートstrandのbinding siteからexitする
    3. シグマ2 (シグマの二番目のドメイン)がノンテンプレートの方のssDNAに結合する
      • ノンテンプレートstrandの2つの塩基、A-11とT-7が二重らせんの外側(逆向き)に裏返る
      • シグマ2とssDNAのバックボーンが結合する
      • この結合はdsDNAとinconsistentなので、より柔軟なssDNAとなって適合する形となる
  • このOpen Complex Formationは外部からのATPを必要とせず、rNTPを必要としない
  • このOpen Complex Formationまで来ると、以後はほとんど確実にtranscriptionされる(transcriptionのcommitted step)
    • 結合がめちゃくちゃ強くて、transcriptを進めてterminateする以外の方法ではなかなか離れない

Open Complex Formationで-11のAと-7のTは凄く重要だが、その周辺もAとTが多い。

Unstable Ternary Complex Formation

RNAの合成を開始するステップ

  • 2 rNTPsがActive Siteに結合
    • 5’末端の一番最初のrNTPはいつもプリン(A/G)
    • 多くはrATP
      • この場合はテンプレートにTが必要
  • 最初の8〜10NTs を合成したあとに、一旦合成が停止される>abortive initiationとかabortive transcriptsと呼ばれる

このabortive initiationは何回も起こり、実際にpromoter escape(合成が開始)が起こるまでに50〜100回くらい行われる。

なぜabortive transcriptsが起きるのか?

  1. promoterの識別で使われるRNAP holoとの強い相互作用が、promoter clearanceを妨げるから。
  2. シグマ3, シグマ4のlinker regionがRNA exit channelに居座っていて、RNAが出ていくのを防いでいるから。

promoter clearanceとは、RNAP holoがpromoterから離れていく事。

Stable Ternary Complex

ここからelongationが始まる。

UnstableからStableへの移行については、abortive transcriptionがどういうモデルで行われているかに関わっている。

abortive transcriptionには3つのモデルが考えられている。(GoogleDriveに保存したMolecularBiologyResourcesも参照)

transient excursions model

ゴムに繋がれているかのように、8〜10 NTsを合成したらRNAPが戻るモデル。

inchworming model

RNAPがびろーんと伸びるモデル。これもどうにかして-10とシグマ2との相互作用はどうにか離れるメカニズムが必要となる。

scrunching model

ssDNAがRNAPの内側に押し込まれるように少し移動して8-10NTs程度の合成が進むモデル。

このあとは、入り口側がより戻されてdsDNAが復活してRNAが離れるか、それとも後ろ側のDNAがより戻されて合成が進むかになる。

FRETを使ってどのモデルか調べる

FRETについては以下を参照。

NuclearPoreの輸送メカニズム - CellBiology706x

FRETはセットアップに5年くらい掛かる大変な実験らしい。

Transient Excursions Modelかの確認

通常のRNAPの中にfluorophoreのついたunnatural amino acidというのを混ぜる。 もう一つのfluorophoreをDNAの-10と-35の特定の場所に置いて、 transient excursions modelならば両者は離れるのでFRETしなくなるはず。 実験としては6bpだけ合成されるようにヌクレオチドを足す。

結果は変化無し。

Inchworming Modelかの確認

次にinchworming modelを確認するためにもっと前の部分にfluorophoreをつけてみたが、 これも変化無かった。

Scrunching Modelかの確認

このケースではDNAの前方と後方にfluorophoreをつければ良いのでunnatural amino acidをつけるよりも簡単だとか。 -35と-10の間に一つ、start sideのdown streamにもうひとつをつける。

これは合成を進めるとFRETが起こった!

どうもScrunching Modelの模様。

8-10 bp程度が合成されると、何が起こるのかを考える。 2つの可能性が考えられる。

  1. down streamがもう一度より戻ってdsDNAとなる
  2. -10方向のupstreamがより戻ってdsDNAとなる>プロモーターescape

この後者のrewindの力が、-35や-10との強固な結合を引き剥がすんじゃないか。

この場合、-10付近のヌクレオチドとRNAPの結合の強さがpromoter escapeのしやすさに影響を与える事になる。 CGペアが多い方がRNAPとの結合は弱く、rewindでより多くの力が生まれてescapeしやすい。

Initiation時に発生するイベントを調べるAssayたち(これまで出てきたの)

  1. Closed Complex Formation
    様々なDNA Binding Assayたちが使える。Gel Shift Assay, Template Association Assay, DNAse Footprintingなど。
  2. Open Complex Formation
    DNA unwinding assay(この場合はKMnO4を使う、RNAPのactive siteまで入り込めるような小さな分子じゃないと使えないから)
  3. UTC (Unstable Ternary Complex)から STC(Stable Ternary Complex)への遷移
    これは難しいので既存の手法ではうまく行かない>新規のAssayへ

Assaysを参照

Initiationを調べるAssay達(新規の)

UTCからSTCへの遷移を調べたい。しかし両者の違いは良く分からないのでこれまでのassayではうまく調べられない。

そこで以下に着目する。

  • UTCは8〜10 ntのRNAを合成
  • STCはFull LengthのRNAを合成

そこで合成されるRNAの量と長さを測ると、両者の比率が分かる。

基本的なアイデアとしては、1 round分のIncorporation AssayをしたあとにGel Electrophoresisを行い、 「8〜10 nt 転写 : Full Lengthの転写」 の比を求める。 そのためには、1 round きっかり測りたい。 そこで使うのがheparin。

Heparin

heparinは普通はblod clottingの抑止に使われるものだが、このassayでも使われる。

heparinはPoly Sulfated Poly Sacharide。一方、DNAはPoly Phosphate Poly Sacharide。そこでheparinは塩基の無い疑似ssDNAとしての役割を果たす。

heparinがあると、RNAPホロは、Closed Complex Formationのステップが抑止される。 でも転写は邪魔しない。ひとたびOpenまで行ったらそこから先はheparinが邪魔する事は出来ず、転写が開始される。

Heparinを使ったTemplate Challenge AssayのようなAssay

  1. まずRNAPホロをDNAのプロモーターに結合させてOpen Complex Formationまで進める。(ここまではrNTP無しで行ける)
  2. rNTPとHeparinを加える
    • Open Complex FormationのRNAPホロはabortive transcriptionとFull Length Transcriptionを行う
    • ひとたびFull Length Transcriptionが行われてDNAから離れると、RNAPホロとHeparinが結合し、もう一度Closed Complex Formationを形成するのを妨げる
  3. 合成を行い、結果をDenaturing Gelで分離、測定
    ここでラベルはrNTPにつけるので、長さによってシグナルの違いがある事に注意。

次:バクテリアにおけるTranscriptionのElongation

バクテリアにおけるTranscriptionのElongation