Endocytosis
Exocytosisは物質が細胞から出ていく過程。
ER＞ゴルジ＞Vesicleとなって細胞膜のレセプターへと行く。
Endocytosisはその反対。
まずVesicleに積荷が入り、逆の過程で細胞に入ってくる。
Vesicleは積荷によって様々な場所で様々に形成される。
例えば入ってきたものがEndosomeを形成するケースがある。
Endosomeは幾つかの行き先がある。
- Lysosomeに行き、そこでdegradationされて再利用される
- 積荷がレセプターの場合は細胞膜に差し戻されて細胞膜として再利用される。
- そのまま細胞質を通過し、反対側の細胞膜へと行く（Transcytosis）
行き先はVesicleによる輸送でも述べた通り、RabやSNAREによって指定される。
30分程度で全ての細胞膜が取り込まれるくらいのendocytosisが起こるらしい。
Endocytosisの種類
- Pinocytosis (液体を飲む)
- non-specificでその辺の液体を取り込む
- Small vesicle。100nm未満とか。
- Receptor-mediated
- Cargo specific（レセプター）
- コレステロール(LDLレセプター)
- Iron （Transferrinレセプター）
- Clathrinが関わる過程が一番良く理解されていて研究されている(EMで普通に見えるので研究しやすい)
- Small vesicle。100nm未満。
- Phagocytosis
- microbes (バクテリアなど)
- Dying cells
- レセプター
- 大きいvesicle。250nm以上。
コレステロールのEndocytosis
- atherosclerosis アテローム性動脈硬化
- impaired 正常な機能を損なった
コレステロールが細胞にどう取り込まれるか？
LDLの一部として取り込まれる。
LDLはLow density lipoprotein。
LDLレセプターがLDLと結合してendocytosisが始まる。
- 細胞の外に出た（複数の）LDLレセプターがLDLと結合する（リガンド）＞Endocytosis開始
- アダプターを動員する(Arf, AP-2, などなど、これは細胞質にある)
- Clathrinを動員する（細胞膜の細胞質側）
- 細胞膜を変形していく（たくさんのLDLレセプターがたくさんのLDLを中に配置し、周りにはadapterとClathrinがいっぱいやってきて変形する）
- Dynaminが球の根本にぐるぐる巻きつく
- DynaminがGTPを加水分解して球の根本をねじ切る
- Uncoat
- GTPaseがアクティベートされる
- シャペロンがコートタンパク質を分離していく
- Endosomeとfuseする
- このpathwayを進んでいくとvesicleの中のpHが下がる＞LDLレセプターとLDLが分離する
- LDLはLysosomeに送られ、レセプターは細胞膜に返却される
Clathrinは三脚ともえ紋の形（triskelion）をしていて、ヘビー鎖を基本にlight鎖が付加している構造。
Arf, DynaminなどはG-protein。
細胞のLDL摂取と血中濃度の関係
細胞のコレステロール摂取が少ないと血中のコレステロール値が上がり、心臓麻痺、脳卒中などの病気を引き起こす。
細胞のコレステロール摂取が減る要因としては例えば以下のようなものが考えられる。
- LDLレセプターの活動が低下する（細胞内のコレステロールが多くなった場合のnegative feedbackなど）
- コートタンパク質などvesicleを作る部分がうまく機能しない
取り込みの早さを測る - Transferrin
Transferrin Receptor (TR)が細胞膜には出ていて、transferrinと結合する。
transferrinはFeを取り込む事。２つのFeを取り込む。
low pHになるとやがてFeは細胞内に放出され、レセプターは再利用される。
この反応を使ってclathrin-mediated endocytosisの反応レートを測る。
Pulse Chaseで測る
- まず4度にしてEndocytosisを止める
- BiotinラベルをTransferrinに付加し、大量にincubate (Biotin-S-S-TF)
- 普通のTransferrinで洗い流す
- 37度に戻して反応開始
- しばらく待って4度に戻す
- 外側に残ってるbiotinラベルを、reducing agentでS-Sの結合の所でカットして切り離す
- 以上を幾つかのtimepointで行って、western blotなどで検出
Biotinに関しては複製の開始に関わるassay達 - Molecular Biology 728xxも参照の事。
streptavidinと結合する。
結合はめちゃ強い。
K_D = 10^-15M
インフルエンザウィルスのハイジャック
Endocytosisの仕組みをハイジャックするインフルエンザウィルスは、Endocytosisの理解を深めるのに良い。
インフルエンザウィルスの構成
- リン脂質2重層
- 表面にHAとNAタンパク質(hemagglutininとneuraminidase）
- 中にRNA
clathrin-mediated endocytosisをハイジャックする。
インフルエンザウィルスのレセプターはSialic Acidを含んだGlycoproteinで、これが細胞膜の表面にある。
- ウィルスがレセプターと結合
- Clathrinが動員されendocytosisが始まる
- visicleが壊れて中身が散らばる
- 細胞核に入る (nuclear pore complex経由)
- 自身を複製しつつ、必要なタンパク質のtranscriptionも起こる
- GenomeとmRNAが核から細胞質に出る(nuclear pore complex経由)
- mRNAからviral proteinの合成が起こる
- 合成されたタンパク質がER＞ゴルジ＞細胞膜の経路で輸送される
- ゲノムも細胞膜へ移動し、exocytosisが起こる
Flu VaccineのターゲットはNAやHAのantibodyで、
これを作れるようになれば、NAやHAに結合する事でウィルスがレセプターと結合するのを防ぐ事が出来る。