アクチンってなんだっけ？と大学生物学の教科書を読み直す。1巻5章のp285あたりから。マイクロフィラメントを作る元となる単量体だった。 なお、微小管の元となるタンパク質はチューブリン。
Intro 700xの方で幾つかlab videoを見た、ビーズの入った試験管に目的のタンパク質を付着させて他を洗い流す奴だな。
SECとIECとAffinityの三種類がある。SECはビーズに孔が空いていて、孔の大きさでフィルタリングする。 IECはイオン。Affinityはリガンドがビーズについている。リガンドはタンパク質の特異的に結合する物質とう定義。
まず細胞を破壊して遠心分離する。
細胞の破壊には
などの方法がある。急速に圧力変化させるのが主流。
破壊したら遠心分離する。
遠心分離は
cytosolからは、charge, size, affinityの違いによる溶けやすさの違いを利用して分離していく。
溶けやすさの違いを利用する時は、塩を加えていってイオンの強度を上げていくとタンパク質の溶けやすさが減るという性質を使う。 この目的にはめっちゃ溶けやすい塩を使う。 (NH4)2SO4、ammonium sulfateが使われる。 NaClはタンパク質に影響が強いので良くない。
例：血漿に２つのタンパク質があるケース。
だから間の、例えば2Mにして遠心分離すればペレットはFIBRINOGENになる。
なお、血漿を凝固させると血清になるらしい。
半透膜に入れたペレットにBufferを注ぐと、(NH4)2SO4だけが膜から出ていく。
透析の後は３つのChromatographyのどれかで分離する。
ビーズの入ったカラムを通して分離する。
Affinity Chromatographyは、目的のタンパク質のligandを持つビーズを使って分離する手法。 以下の２つの条件が必要。
例：グルコースにくっつくタンパク質を分離したい場合
例：トランスクリプションファクターを分離したい場合
対応するDNAシーケンスを持ったビーズを使う。elutionではDNAを加える。
例：リガンドを作る（タグ）
His-TAG：目的のタンパク質からDNA配列を取り出し、その後ろにHistidinが連なるようにコドンを追加する。Histidinはニッケルやコバルトと高いAffinityを持つので、それらのビーズのカラムを使えば良い。ElutionにはHistidinを使うか、その側鎖のImidazoleを加えれば良い。
GST-TAG：Gultathione S-transferaseタグ。26000ダルトン。これがgultathioneにくっつくので、gultathioneのカラムを作って分離する。
この動画は少しわかりにくいが、以下のように理解した。（この後にあったSpecific Activity Animationは凄く良く構成されているので先にこれを見るべきだった、というか先に置いておいてよ…）
タンパク質をpurifyする時に、何か目的のActivityがある場合。
Activityの総量/タンパク質の総量
をSpecific Activityを呼ぶらしい。 Specific Activityを知る為には、当然以下の２つを知っている必要がある
この２つが分かれば、 Activityの量/タンパク質の量 を計算出来る。
Activityの量はまさに目的のActivityなので目的による。例えばEcoRIならDNAをカットするとか。 これが何らかのUnitで測れるとする。
すると次に必要なのは「タンパク質の量」を知る方法。 その為には濃度を知る必要がある。
濃度を計測する方法は、例えば280nmとか276nmの波長の光の吸収を測る（TyrかTrp）というのがあった。
A = εcl
ここでεはタンパク質内のTrpとTyrの個数の和の何らかの関数。
ただpurificationしていく時にSpecific Activityに着目してpurifyの度合いを知りたいと思えば、 いろいろなものが混ざっている時にも使える濃度推定法があって欲しい。上記の方法はDNAとかいろいろ余計なものが混ざっている混合液に対してはあまり良い方法とは言えない。
そこでDye binding assayで測るという方法がある。
reagentがタンパク質に結合した時に起こる色の変化を測ることでタンパク質の濃度を測る手法。 何故か動画じゃなくてテキストの資料ののみ（なんで！？）。
Bradford assay:
Coomassieはタンパク質と結合すると、465nm(red/brown)が最大吸光だったのが、595nm（blue/purple）に変化する。 そこで595nmの吸光を測ることで、Coomassie-タンパク質 結合体の量が測れる。
BCA assay:
Step 1はアミノ基との反応でbiuret反応として知られる。Cys, Tyr, Trpの側鎖もこの還元作用があるのでタンパク質の種類による違いがある。
562nmの吸光を測る事でBCA-copper complexの量を測る。
PngNoteの方に表を書いたのでそちらを参照。＞PngNote、16ページ
SDS-PAGE
電気泳動の亜種。タンパク質をまっすぐにしてアミノ酸数に応じた電荷を付与して電気泳動する事で、molecular weightで分離する。 ＞PngNote 18ページ 18〜20ページがSDS-PAGE
ジスルフィド結合をバラす為にreducing agentsとしてβ-mercaptoethanolを加える。
IEF
pHの違いで電荷が変わるのを利用して分離、pIがタンパク質ごとに違う事を利用。
2D-ゲル電気泳動
IEFしてからSDS-PAGEする事でmolecular weightとpIの両方で分離。
GFP（クラゲからとる蛍光塗料、ベータバレルのタンパク質の奴）のpurificationの例。 この動画、なんか700xの方でも見た奴な気がするな。まぁいい。見ておこう。
high salt bufferで疎水部が外に出てきて疎水結合でビーズに残り、 low salt bufferを加えると親水部が外に出てきてビーズから離れる（elution）。
high saltとlow saltと疎水基の関係はいまいち良くわからないな。なんでだろう？
そうか、high saltの時はわからないが、low saltの時に疎水基が中に入るのは、水から離れるの定義から明らかか。
blog: MITx 7.00x Introduction to Biology - The Secret of Lifeの受講記録の 「Protein Purification - GFP」の所に当時の理解が書いてあるな。
これも700xでやった動画だね。ただ理解は深まっている。
ligandを使ったaffinity chromatography。ligandが何なのかは知らんが、なんかあるのだろう。
elutionは高pHを使うらしい。これでligandとの非共有結合がはずれるとか。
Activityの検出にはO-ニトロフェニル-ベータd-galactosidase、略称ONPGを使うとか。 Beta-galactosidaseがあるとONPが生まれて、これはアルカリ性だと黄色になるとか。 アルカリ性にするにはsodium carbonateを使うらしい(Na2CO3か)。
どれだけ黄色かを測るには、cuvetteと言われるプラスチックのコンテナに入れてspectrophotometerと呼ばれる機械で測るとか。前もやったな、これ。
Size-Exclusion Chromatographyは、ビーズの孔を通る、小さいMwのタンパク質の方が長く時間がかかるのか。