MicrotubuleやActinに関わる力の生成についてのメカニズムやそのAssayを学ぶ。
以下に出てくるassayで測れるものを書いておく。
| assayの種類 | Movement/rate | Processivity | Step size | Force production | Directionality |
|---|---|---|---|---|---|
| Motor Gliding Assay | x | x | |||
| Motor Motility Assay | x | x | x | ||
| Optical Trap Assay | x |
TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy)で調べる。 カバースリップの所で全反射させると表面の少し(100〜200nm)しか光が届かない現象を利用してSingle Molecule assayを実現する手法。
カバースリップにmotor タンパク質をくっつけて、microtubuleを上に乗せる＞microtubuleが動く
カバースリップにmicrotubuleをくっつけて、Fluorophoreをモータータンパク質側にくっつける。 １つのタンパク質の動きを観測する。
ATPの濃度を低くする。 22ページの図参照。
microtubuleやactinを動くほとんどのmotorタンパク質は2 head。筋肉のmyosinだけは1 head。
conformational changeを測りたい。 そのためにはtailでは無く、headの方、しかも２つのheadのうちの片方にfluorphroeをつける。 tailとheadはややこしいが、microtubuleにくっつく方がhead、浮いてる方がtail。足に見えるのがheadなのがややこしい。
尺取り虫の動き方なら8nmずつ動くが、ツイストスタイルなら16nm動くはずなので、この２つのどちらかを区別出来る。
また、atomic force microscopyでも調べられるとの事。以下の研究の動画が参照されていた。 Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy - PubMed
金沢大学。へー。
キネシンの機構がよく書けていたのでリンクを貼っておく。
誘電体のビーズとしてはpolystyreneビーズなどをつかう。
レーザーが一番細くなる所にトラップされる性質を使って、１つの分子がstallするギリギリの力をかけることで、ひっぱる力を観測する。
カバースリップにMicrotubuleをつけて、motorタンパク質に誘電体のビーズをつけて、stall forceを測る。
適当な壁をポリメライズしたActinが押すように、ビーズとacrosomeをつけてActinフィラメントを合成する。 acrosomeはnucleationの起点となる物質で、こちら側がマイナスendとなる。
ポリメライズが進めば壁を押してビーズが進もうとするのでこれをlight beamでstall forceを測る。 すると1.3pN程度。これはブラウン運動で揺れている間にどんどんactinモノマーが割り込んでいく事から押していく感じになる。
Listeriaなどは200pN以上の力を生んでいるが、この1.3pNとの違いはどこから来るのか？＝＞枝分かれが重要
枝分かれによってたくさんのフィラメントが同じ方向に押すので力が増す。
PngNoteの25ページ（から次の26ページにかけて）
Mitosisでの染色体の移動では700〜1000pN程度の力が出ている。 当初はモータータンパク質が運んでいるかと思ったが、遺伝子工学的にモータータンパク質を外しても動く事が確認された。 ＝＞Microtubuleのdepolymerizationによる力で動いていると思われる
kinetochoreがMicrotubuleのプラス末端に結合していて、Microtubuleがカタストロフでめくれていく時の力で移動してく。
ビーズをMicrotubuleの途中に共有結合でくっつけてOptical Trapでめくれる力に反するようにひっぱる事でstall forceを測る。
ポリメライゼーションでは押す力で運ばれるので特別なメカニズムは必要なかったが、デポリメライゼーションでは引っ張られる側の向きなので、何らかの仕組みでCargoを運ぶ必要がある。
菌類ではDam1 ComplexというリングがMicrotubuleにかかっていて、これがCargoと結合して引っ張っていく事が分かっている。 そのほかの生物ではまだ良く分かっていない。